摘要：免疫組織化學用于研究組織中蛋白質的定位。通過帶有顯色劑或熒光標記的抗體對抗原的特異性結合，可以實現組織中蛋白質的可視化，從而對組織和細胞中的蛋白質進行定性，定位，定量等分析。免疫組化通常分為一步法和兩步法。在一步法中，特異性抗體上直接帶有顯色劑或熒光基團。在更廣泛使用的二步法中，被固定和通透化的組織首先與一抗混合。在一抗特異性結合目標蛋白后，加入帶有顯色劑或熒光基團的二抗特異性結合一抗，使目標蛋白可以在顯微鏡下被觀察到。
?
本方案以果蠅卵巢為例，結合綠色熒光蛋白對兩種蛋白同時進行免疫熒光染色，用聚光掃描共聚焦顯微鏡同時進行四通道掃描，從而達到對三種蛋白以及DNA在細胞中的分布進行同步分析。
?
?
材料與試劑
???? 1）培養皿
???? 2）載玻片
???? 3）蓋玻片
???? 4）雌性果蠅成蟲
???? 5）Grace’s Insect Medium
???? 6）4%多聚甲醛 (paraformaldehyde, PFA)
???? 7）PBS (10×) (Beyotime, ST476)
???? 8）Triton X-100
???? 9）馬血清
???? 10）一抗 (特異性結合目標蛋白)
??????????? 兔抗c-Myc
??????????? 山羊抗CTP合成酶 (CTP synthase, CTPS)
???? 11）二抗 (帶有熒光基團，特異性結合一抗)
??????????? Texas Red狗抗山羊IgG
??????????? Cy5狗抗兔IgG
???? 12）DNA熒光染料: Hoechst 33342
?? ? 13）凡士林
???? 14）指甲油
???? 15）磷酸緩沖液 (1× PBS) (見溶液配方)
???? 16）PST (1×) (見溶液配方)
?
儀器設備
?
???? 1) 鑷子
???? 2) 解剖顯微鏡 (OLYMPU SZ61)
???? 3) 移液器
???? 4) 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡 (Leica SP5II或者SP8)
???? 5) 果蠅二氧化碳麻醉工作站
?
實驗步驟
?
一、 組織解剖和固定
???? 1. 在飼養果蠅的容器中通入二氧化碳使果蠅麻醉，將果蠅倒出，置于表面通有二氧化碳的墊板上，挑選雌性果蠅。
???? 2. 在培養皿中倒入Grace’s Insect Medium，將果蠅置于液體中。用鑷子輕輕固定住果蠅腹部的前部，用另一把鑷子夾住果蠅腹部的倒數第二個體節，并將這部分從果蠅身體上扯下，卵巢會被一起扯出 (圖1)。盡快將卵巢轉移至新的培養皿中，卵巢上附著的組織將會在后續步驟中被清除。
注：1)?解剖和固定在室溫下進行，試劑應在從冰箱拿出后放至室溫后再使用。2)?可使用移液器進行轉移，在轉移之前剪去移液管頂部的一部分使其能吸入卵巢大小的組織。如果組織容易粘在管壁上，可以先在新的培養皿中滴入一滴Grace’s Insect Medium，將鑷子夾在組織不易破損或者對于實驗不重要的部分，輕輕夾起組織，置于新培養皿的液滴中，放下組織。
?????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. 解剖果蠅卵巢示意圖.?
?????? A. 用鑷子輕輕固定住果蠅腹部的前部，用另一把鑷子夾住果蠅腹部的倒數第二個體節。B. 左手鑷子固定果蠅身體，右手鑷子將果蠅尾部兩個體節輕輕拉出，卵巢會被一起扯出。這時不必對解剖組織進行清理，迅速開始解剖下一只果蠅。左撇子的拿鑷子解剖方式與此呈鏡像對稱。
???? 3. 使用移液器盡可能多的移去組織周圍的Grace’s Insect Medium。
???? 4. 使用移液器在組織上滴加200 μl 4% PFA，使組織浸沒在液滴中。在室溫下靜置固定10分鐘。
???? 5. 使用移液器盡可能多的移去卵巢周圍的PFA。
???? 6. 加入2 ml PBS，輕輕搖晃培養皿，洗去殘留的PFA，移去PBS。一次即可。
???? 7. 加入PST，在解剖顯微鏡下去除卵巢周圍附著的其他組織。
???? 8. 將卵巢使用移液器轉移至600 μl離心管中，加入400 μl PST，儲存于4 °C或立即用于接下來的實驗。
???? 注：根據組織和固定情況的不同，組織的有效的保存時間會有較大差異。為了取得最佳的染色效果，盡量使用新鮮制備的樣品。?
二、 免疫組化染色
?
???? 1. 使用PST稀釋抗體原液，按比例配制20 μl體積的一抗溶液，使得一抗最終稀釋比例在1:200至1:1,000之間，或者是抗體終濃度為1 μg/ml。
????? 注：在本示例中一抗 (兔抗c-Myc，山羊抗CTPS) 的稀釋比例為1:200，一抗的濃度應根據具體情況進行調整。?
???? 2. 將兩對固定好的卵巢使用移液器轉移至新的600 μl離心管中。
注：卵巢屬于相對較大的組織，一般在20 μl的抗體溶液中加入2對卵巢。在抗體濃度相同的情況下，樣品越少染色效果越好。?
???? 3. 使用移液器盡可能多的移去卵巢周圍的液體。
???? 4. 加入20 μl一抗溶液。
???? 5. 室溫孵育過夜。
???? 注：一抗最佳孵育時間與溫度和樣品的情況有關，一般一抗孵育不超過一天。?
???? 6. 使用PST稀釋并配制二抗溶液，使得二抗最終稀釋比例在1:200至1:1,000之間。加入DNA染料 (DAPI或Hoechst，稀釋比例1:1,000)，總體積為20 μl。
注：本示例中二抗 (Texas Red狗抗山羊IgG; Cy5狗抗兔IgG)的稀釋比例為1:250，Hoechst 33342的終濃度為1 μg/ml。二抗和DNA染料的濃度應根據具體情況進行調整。?
???? 7. 使用移液器盡可能多的移去卵巢周圍的一抗溶液。
???? 8. 使用移液器加入200 μl PST，輕輕吹打，洗去殘留的一抗，移去PST。
注：如果樣品成像時背景信號較強，可多次重復這一步。?
???? 9. 加入20 μl二抗溶液。
???? 10. 室溫孵育過夜。
?????? 注：1)?二抗最佳孵育時間與溫度和樣品的情況有關，如果樣品成像時信號較弱，可以選擇延長二抗孵育時間至兩天或更長。2)如需儲存，可以在二抗孵育過夜后將樣品繼續放在二抗溶液中在4 °C保存。保存時間過長會導致較強的背景信號。?
?
三、 制片與成像
?
???? 1. 在紙巾上放置一片蓋玻片。
???? 2. 在蓋玻片的四角涂上凡士林
???? 3. 使用移液器將卵巢和15 μl左右的二抗溶液一起轉移至蓋玻片上。
????? 注：在二抗溶液濃度合理的情況下，不需要洗去二抗。?
???? 4. 將載玻片輕壓在蓋玻片上，使蓋玻片通過凡士林粘在載玻片上，翻轉載玻片，使蓋玻片在上，置于紙巾上。
???? 5. 使用移液管輕壓蓋玻片的四角，使四角的高度盡量相同，趕出載玻片和蓋玻片之間的氣泡。
???? 6. 如有液體溢出，輕輕用紙巾吸去。
???? 7. 使用指甲油密封蓋玻片的四邊。
???? 8. 待指甲油晾干后，可使用熒光顯微鏡或共聚焦熒光顯微鏡進行成像。
?????? 注：在制片完成后應盡快進行成像。如果無法及時進行成像，應如免疫組化染色 (8) 中所述保存在二抗溶液中，在成像之前再取出制片。?
?
?
結果與分析
?
?????? 核苷酸CTP的從頭合成的限速反應由CTPS催化。我們之前的工作表明，CTPS在果蠅卵巢里的細胞以及其他組織中可以形成蛇形的細胞內結構，我們把這種結構稱為細胞蛇 (英文單數是cytoophidium；復數是Cytoophidia) (Liu, 2010)。
? ? ? ?在尋找CTPS組裝成細胞蛇的因子研究中，我們發現原癌基因Myc表達量對細胞蛇的形成有影響。因此，我們利用果蠅遺傳手段，以果蠅卵巢中的單層上皮細胞濾泡細胞作為研究模型。細胞核中的GFP表明該細胞中Myc會因為RNA干擾而表達水平降低。對此，我們在解剖果蠅獲得卵巢，并進行固定之后，同時用兩種一抗 (兔抗c-Myc，山羊抗CTPS) 與樣品孵育，室溫過夜。
?????? 第二天把一抗用PST溶液清洗一遍。然后向裝有樣品的小管中同時加兩種二抗 (Texas Red狗抗山羊IgG; Cy5狗抗兔IgG)，并且加入DNA熒光染料Hoechst 33342，孵育，室溫過夜。次日可以制片用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照。
? ? ? ?由于我們所用的四個不同染料 (Hoechst 33342，GFP，Texas Red和Cy5) 的激發光和收集光光譜均有不同，這樣我們可以在激光掃描顯微鏡下開通四個通道，同時檢測DNA和三種蛋白質 (GFP，CTPS和Myc) (圖2)。這樣我們就可以清晰并且直接的觀察到，在Myc被敲低的細胞里 (GFP陽性)，Myc的免疫染色幾乎沒有 (圖2D)。與之對比的是對照細胞 (GFP陰性) 里Myc免疫染色信號在細胞核里很明顯 (圖2D)。對應的是，Myc蛋白水平高的細胞 (GFP陰性) 里CTPS可以形成纖維狀細胞蛇 (圖2C)，而Myc蛋白水平低的細胞 (GFP陽性) 里則看不到CTPS組成的細胞蛇(圖2C)。這種多組分相互關系可以用不同色彩在疊加圖中展示 (圖2E)。因此，這個免疫組織化學的結果支持Myc對CTPS組裝成細胞蛇有調控作用 (Auguey等，2016)。
?
溶液配方
????? 1) 磷酸緩沖液 (1× PBS)
????????? 使用去離子水稀釋PBS (10×) 至1×
????? 2) PST (1×)
????????? 1× PBS
????????? 0.3% Triton X-100
????????? 0.5%馬血清
?
致謝
?
劉冀瓏實驗室的工作得到上海科技大學，英國牛津大學以及英國醫學理事會的支持。本文實驗方案改編自本實驗室的發表文章Tastan和Liu (2015) 和Aughey等 (2016).
?
參考文獻
?
Copyright:???2019?The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：吳錚 , 劉冀瓏 . (2019). 果蠅組織免疫組織化學. Bio-101: e1010256. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010256.
How to cite:?Wu, Z. and Liu, J. L. (2019). Immunohistochemistry of Drosophila?Tissues. Bio-101: e1010256. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010256.
?
